重組蛋白分離純化的基本原則

　　不管黑貓白貓，抓到老鼠就是好貓，對(duì)純化來(lái)講亦如此，能拿到純度好的蛋白，符合純化要求就是硬道理。不同蛋白純化工藝不同，即使相同的原料也有不同的純化方案。蛋白質(zhì)純化方法的選擇主要是利用不同蛋白質(zhì)之間的相似性與差異，依據(jù)蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，在根據(jù)蛋白的差異性將目的蛋白分離出來(lái)，所以要取得好的純化結(jié)果所可以采用的策略及原則卻是共通的。

　　1.針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采用不同的策略：

　　a)融合型表達(dá)重組蛋白，一般胞內(nèi)可溶性的，擬選用親和層析進(jìn)行純化；

　　b)分泌型表達(dá)的重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理；

　　c)包涵體型表達(dá)的重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體；

　　d)表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。

　　2.針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型：

　　a)離子交換法（IEX）：等電點(diǎn)處于區(qū)域（PI≤5或PI≥8）的重組蛋白應(yīng)選IEX進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白。

　　b)親和層析（AC）：重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是親和層析純化的重要條件，原則是它們與目的蛋白之間的解離常熟應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（10-8—10-4mol/L）

　　c)疏水（HIC）和反相層析：根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的。

　　d)凝膠過(guò)濾層析（GF）:根據(jù)蛋白的分子量進(jìn)行分離。

　　3.每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡：

　　a)分辨率：由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來(lái)完成。當(dāng)雜質(zhì)和目的蛋白性質(zhì)相似是，在純化的zui后階段分辨率是選擇層析方法的重要考量標(biāo)準(zhǔn)。

　　b)處理量：指在純化過(guò)程中目標(biāo)蛋白的上樣體積和濃度等。

　　c)速度：在初純化中是重要因素，此時(shí)雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快去除。

　　d)回收率：隨著純化的進(jìn)行漸趨重要，因?yàn)榧兓a(chǎn)物的價(jià)值在增加。

　　4.多種分離純化技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用：

　　a)選能除去含量zui多雜質(zhì)的方法；

　　b)盡量選擇的分離方法；

　　c)將zui費(fèi)時(shí)、成本zui高的分離純化方法安排在zui后階段。

　　d)通過(guò)組合各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至zui少，以避免需要調(diào)節(jié)樣品。*個(gè)步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜下一個(gè)步驟的起始條件。

　　e)如果對(duì)目的蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下，可采用IEX-HIC-GF的聯(lián)合運(yùn)用作為標(biāo)準(zhǔn)方案。

　　5.重組蛋白分離純化的共同參考階段：

　　a)捕獲階段：目的蛋白的澄清、濃縮和穩(wěn)定。選擇對(duì)目的蛋白具有zui高選擇性或/和處理量的方法。

　　b)中度純化階段：目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。

　　c)精純階段：除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。